在使用時，我們需要先把目鏡測微尺裝入目鏡筒中，具體操作為：先把目鏡從顯微鏡上拔下來，在遠離鏡片（也就是我們平時觀察時看的地方）的一端有個齒輪狀的圓形結構，把它擰開，然后把目鏡測微尺裝入其中，注意正面要放于視場光闌上，然后將其擰回去，放回目鏡就行了。有的的顯微鏡由于結構精密，不允許拆卸，需專門配有測微尺的目鏡。然后將測微臺尺放于載物臺上，調節(jié)顯微鏡焦距知道能看到臺尺清晰的刻度為止。這時調整讓兩尺子的一端在整刻度重合，然后尋找另一端在什么地方重合，數(shù)出他們重疊部分的格數(shù)就能算出目鏡測微尺在放大情況下的實際倍率了。

        具體計算公式如下：

目鏡測微尺每格=（臺尺重疊數(shù)X10）÷目尺重疊格數(shù)。如上圖臺尺的重疊格數(shù)為4格，目鏡測微尺的重疊格數(shù)為10格。由此可以計算出目鏡測微尺每格代表的長度為：（4X10）/10=4um。

        確定好目鏡測微尺每格代表的長度后移開臺尺，之后使用時就能用它確定被檢物實際長度了。由于生物顯微鏡有多個物鏡，每個物鏡放大倍率不同，目鏡測微尺在不同倍率下所代表的實際長度不同，因此在切換倍率時應重新校準。